一、過敏原皮膚試驗

　　皮膚試驗簡稱皮試，是在皮膚上進行的體內免疫學試驗。當試驗抗原進入致敏者皮膚時，皮膚中結合有IgE的肥大細胞或致敏T細胞就會與試驗抗原結合，引發即刻型或遲發型的皮膚超敏反應。試驗抗原也可從注射部位進入微血管，與循環中的相應抗體結合，形成的免疫復合物可在局部沉積，激活補體引起炎癥。所以皮膚試驗主要用于檢測Ⅰ型和Ⅳ型變態反應，有時也用于檢測Ⅲ型變態反應。

　　（一）試驗準備

　　首先應當制備試驗用抗原，如有合格商品可直接購買。可以作為變應原的物質種類繁多，例如動物皮毛、家禽羽毛、鴿糞、昆蟲、螨類、真菌、花粉、雜草、物理粉塵和各種食品等都可能成為變應原。

　　不同抗原的制備方法不同，但一般包括以下幾個步驟：①收集原料；②粉碎與勻漿；③脫脂與提取；④過濾與分離；⑤分裝保存。分裝保存之前應對提取產物進行鑒定。首先必須經過無菌試驗、急性毒性試驗和熱原檢查，保證提取產物無明顯的毒副作用；還要測定產物的蛋白含量，用凱氏定氮法或磷鎢酸沉淀法標定出總氮單位或蛋白氮單位。

　　試驗部位應清洗干凈，嚴格消毒，以免皮膚的不潔物引起非特異性反應或感染。當皮膚患濕疹、感染、皮炎或外傷時不宜進行皮膚試驗。正在或近日服用免疫抑制劑或抗組胺藥物者也不宜進行皮膚試驗。

　　（二）試驗類型及方法

　　皮膚試驗的最常用部位是前臂屈側，因此處皮膚較為光滑細膩，而且便于試驗操作和結果觀察。按正規作法，左右兩臂一側作試驗，另一側作對照。需要時也可選用上臂或背部皮膚。具體試驗方法可分為皮內試驗、挑刺試驗和斑貼試驗。

　　1.皮內試驗：將試驗抗原與對照液各0.0l～0.03ml用皮試針頭分別注入皮內（不是皮下），使局部產生一個圓形小丘。當同時試驗多種抗原時，相互間至少間隔2.5～5cm，以免強烈反應時互相混淆結果。

　　皮內試驗的敏感性比其他皮膚試驗高，所用抗原應適當稀釋，以免出現嚴重反應；當高可疑性抗原出現陰性結果時，應逐漸加大抗原濃度進行重復試驗。

　　皮內試驗是最常用的皮膚試驗。應用范圍也很廣，幾乎各類抗原及各型反應都可用皮內試驗進行測定，只是不同類型的反應觀察結果的時間和判定結果的標準有所不同。

　　2.挑刺試驗：也稱點刺試驗或刺痕試驗。將試驗抗原與對照液分別滴于試驗部位皮膚上，用針尖透過液滴或在皮膚上輕輕地挑刺一下，以刺破皮膚但以不出血為度；1min后拭（吸）去抗原溶液。同時試驗多種抗原時，千萬注意不要將不同的抗原液交叉混合，以免出現假陽性。

　　挑刺試驗主要用于Ⅰ型變態反應，該法雖比皮內試驗法敏感性稍低，但假陽性較少，與臨床及其他試驗的相關性較強。

　　劃痕試驗是挑刺試驗的一個變型，用三棱針或注射器針頭在皮膚劃一條或多條約lcm長的創痕。因為劃痕的輕重與長短難于掌握一致，故不常用。

　　3.斑貼試驗：將試驗抗原直接貼敷于皮膚表面的方法。主要用于尋找接觸性皮炎過敏原。試驗抗原為軟膏時可直接涂沫在皮膚上；如為固體物時可用蒸餾水混合或浸濕后涂敷于皮上；如為水溶液則浸濕紗布后敷貼于皮膚上。所用抗原濃度以不刺激皮膚為原則，涂敷范圍以0.5～1cm為宜。涂敷后蓋以油紙或玻璃紙，用紗布或繃帶固定；如有明顯不適感可隨時打開查看，并進行適當處理。斑貼試驗主要是檢測Ⅳ型變態反應，敏感程度雖然不太高，但假陽性較少，結果的可信度大。

　　（三）結果判定及分析

　　1.Ⅰ型變態反應在抗原刺激后20～30min內觀察結果。挑刺試驗的陽性反應以紅暈為主，皮內試驗的陽性反應則以風團為主，判定標準見有關文獻。

　　2.IV型變態反應在接觸抗原后24～72h內觀察結果。皮內試驗的陽性結果以紅腫和硬結為主，斑貼試驗的陽性結果以紅腫和水皰為主。判定標準見有關文獻。有時候，機體對某變應原可能同時存在多種類型的反應。例如在做青霉素皮內試驗時，30min內觀察呈陰性反應，但在5～8h可能會出現Ⅲ型變態反應，反應的外觀現象介于Ⅰ型與Ⅳ型變態反應之間；甚至還可能出現型變態反應。

　　3.假性結果：在一定條件下，皮膚反應的結果可能與機體的實際情況不符，即出現假陽性或假陰性等不真實的結果。

　　出現假陰性的常見原因有：①試驗抗原的濃度過低，或者因各種原因失效；②試驗時正確服用免疫抑制劑或抗組胺藥物（后者可通過設立組胺陽性對照而判斷出來）；③操作誤差，例如皮內試驗時注射過深進入皮下，注入抗原量過少等；④皮試季節選擇不當，例如花粉季節過后，抗花粉抗體水平可下降。

　　出現假陽性的常見原因有：①試驗抗原不純，在提取、配制，甚至在試驗過程中被其他抗原污染，引起交叉反應；②試驗溶液配制不當，過酸或過堿都會對皮膚產生非特異性刺激；③皮膚反應性過強，例如被試者患有皮膚劃痕癥，或者有既往過敏的痕跡等；④操作不當，例如注入少量空氣也可出現假陽性。

　　（四）應用與評價

　　皮膚試驗屬于活體試驗，雖然影響因素眾多，卻能反應機體各種因素綜合作用的實際免疫狀態；并且簡單易行，結果的可信度大；這些優點是其他方法難以替代的，所以在臨床和防疫工作中都經常應用。

　　1.尋找變應原：變態反應防治的重要原則之一是回避變應原，而回避的前提是明確變應原。確定變應原的常用方法是各種類型的皮膚試驗。例如支氣管哮喘和蕁麻疹等均可用皮膚試驗來幫助診斷。但食物過敏與皮膚試驗的相關性較差，這可能是因為食物的抗原提取液與腸吸收的物質有所不同，或食物過敏并非IgE所介導；而且食物過敏的變應原容易發現，一般不必作皮膚試驗。

　　2.對患者首次注射某批號的青霉素、鏈霉素預防藥物或疫苗過敏或其他易過敏藥物之前，必須做過敏試驗；如果患者呈陽性反應（即使是可疑陽性），就應更換其他抗生素。注射異種抗血清（例如抗破傷風血清和抗狂犬病血清）前也必須做過敏試驗，如果呈陽性反應就需要換用精制抗體；或進行脫敏治療（少量多次注射，使抗原逐漸中和血液中的抗體）。

　　3.評價宿主細胞免疫狀態：在可疑免疫缺陷病、腫瘤或器官移植時，了解患者的細胞免疫狀態對疾病診斷和預后判斷都有重要意義。這種情況下可以使用共用抗原結核菌素（OT或PPD）或雙鏈酶（SD-SK）進行皮膚試驗；或使用人工合成的二硝基氯苯（DNCB）或二硝基氟苯（DNFB）等先進行致敏再作皮膚試驗，這樣可消除抗原接觸史不同所致的誤差。

　　4.傳染病的診斷：對某些可疑的傳染病，用某種病原體的特異性抗原進行皮膚試驗可以起到診斷或鑒別診斷的作用。例如對布氏菌病和軟下疳等細菌感染、對某些病毒感染和真菌感染、以及某些寄生蟲感染均有一定的意義。

　　另外，還有一些反應機制不同于變態反應的中和性皮膚試驗，例如診斷白喉的錫克試驗和診斷猩紅熱的狄克（Dick）試驗等。

　　二、血清lgE的檢測

　　IgE是介導Ⅰ型變態反應的抗體，因此檢測血清總IgE和特異性IgE對Ⅰ型變態反應的診斷和過敏原的確定很有價值。

　　（一）血清總IgE的測定

　　正常情況下血清IgE僅在ng／ml水平，用常規測定IgG或IgM的凝膠擴散法檢測不出IgE，必須用高度敏感的放射免疫測定法及酶聯免疫測定法和化學發光法等進行檢測。

　　1.放射免疫吸附試驗（IRST）：是將抗IgE吸附到固相載體上用以檢測血清IgE的方法，故又稱固相放射免疫測定（SPRIA）。臨床常用雙抗體夾心法，多以濾紙為載體。將抗IgE抗體偶聯到經溴化氰活化的濾紙上，使其與待檢血清及IgE參考標準進行反應；洗滌后加入125I標記的抗人IgE，再經洗滌后測定濾紙片的放射活性，其測定值與標本中的IgE含量呈正相關。

　　2.酶聯免疫測定法：測定血清IgE時也常用雙抗體夾心ELISA法，操作方便，敏感性也很高，在臨床上經常應用。

　　3.間接血凝試驗：用抗IgE致敏紅細胞，將標本血清做系列稀釋后與致敏紅細胞反應。此法更加簡便易行，便于普及，但敏感性比上兩法稍低。

　　4.化學發光法：用化學發光物質標記抗IgE，與血清中的IgE反應后，通過化學發光分析，計算出IgE含量。此法敏感性特異性均較好。

　　（二）特異性IgE的測定

　　過敏患者的血清中存在著具有變應原特異性的IgE稱之為特異性IgE，如對牛奶過敏者則有針對牛奶變應原的IgE；對蒿草花粉過敏者，則有針對該花粉的IgE，該抗體只能與該變應原特異性結合。因此需要用純化的變應原代替抗IgE進行檢測。

　　sIgE檢測方法有許多種，目前臨床上常用的有ELISA，FEIA，免疫印跡等。隨著sIgE測定技術的完善，此項測定已日趨商品化，開發了各種檢測系統，如CAP過敏原檢測系統，Master過敏原檢測系統，Px過敏原檢測系統等，這些測定系統包括了儀器、試劑、計算機軟件處理系統。國內目前應用最多的是CAP檢測系統。

　　1.放射變應原吸附試驗（RAST）：將純化的變應原與固相載體結合，加入待檢血清及參考對照，再與同位素標記的抗IgE抗體反應，然后測定固相的放射活性，通過標準曲線求出待檢血清中特異性IgE的含量，或在標本放射活性高于正常人均數加3s時判為陽性。

　　2.酶聯免疫測定法試驗：原理及步驟基本同RAST，僅是最后加入酶標記的抗IgE，利用酶底物進行顯色。測定結果的表示也與RAST相同。

　　3.CAP檢測系統：CAP，一個很小的塑料帽狀物，其內置有多孔性、彈性和親水性的纖維素粒，此粒多孔，吸咐了的變應原，加人血清，血清中的sIgE就會和變應原結合，再加入酶標抗人IgE，再加入熒光顯色系統，在熒光分光光度計上測定熒光強度，計算機提供相應軟件，自動計算出結果。報告sIgE含量。

　　（三）臨床意義

　　1.血清總IgE：血清總IgE水平一般用國際單位（IU）或ng表示，1IU=2.4ng，相當于WH0標準凍干血清制劑0.00928mg內所含的IgE量。正常人群IgE水平受環境、種族、遺傳、年齡、檢測方法及取樣標準等因素的影響，以致各家報道的正常值相差甚遠。嬰兒臍帶血IgE水平小于0.5IU／ml，出生后隨年齡增長而逐漸升高，12歲時達成人水平。成人血清IgE水平約在20～200IU／ml之間，一般認為大于333IU／ml（800ng／ml）時為異常升高。

　　與IgE升高相關的常見疾病有：過敏性哮喘、季節性過敏性鼻炎、特應性皮炎、藥物性間質性肺炎、支氣管肺曲菌病、麻風、類天皰瘡及某些寄生蟲感染等。上述疾病時IgE升高的程度并不一致，在過敏性支氣管肺曲菌病時最為顯著，其值可達5000～20000ng／ml，除了此病和特應性皮炎以及在花粉季節之外，任何血清總IgE水平大于5000ng／ml的患者均應考慮寄生蟲感染的可能性。

　　2.特異性IgE：slgE測定是體外檢測變應原的重要手段。主要用于Ⅰ型超敏反應的診斷。其試驗的靈敏度及特異性都很高、特別是對花粉、螨類、寵物皮屑、牛奶、雞蛋、堅果等變應原的sIgE測定，靈敏度和特異性都在90%以上，有的甚至接近l00%.根據sIgE含量可確定患者變應原種類，可評價患者過敏狀態，脫敏治療的療效，對哮喘的診斷和鑒別診斷有重要幫助。

　　RAST（放射變應原吸附試驗）是目前公認的檢測Ⅰ型變態反應的有效方法之一，具有特異性強、敏感性高、影響因素少、對患者絕對安全等優點；不但有助于過敏性哮喘的診斷，對尋找變應原也有重要價值。RAST與皮膚試驗和支氣管激發試驗的符合率在80%左右，但不能完全代替后兩種試驗，因為活體試驗還能反映嗜堿性粒細胞和靶細胞的反應性。

　　但是RAST也有許多缺點：費用昂貴、花費時間長、放射性同位素易過期而且污染環境、不同試劑盒的參比血清不同而不易相互比較、待檢血清含有相同特異性IgG時可干擾正常結果。目前國內應用較少。

　　因此一般只在下列情況下才做RAST：①皮試結果難以肯定，但需提供進一步的診斷證據者；②不適宜做皮試或激發試驗者，例如老年、幼兒、妊娠婦女、患有皮膚病、對變應原有嚴重過敏史或正服用抗過敏藥物以及重病者；③觀察脫敏治療效果或研究變態反應機制。

　　ELISA法與RAST有相似的優點，而且還有獨特的長處，如沒有同位素污染、酶標抗體可長期保存，因此在國內應用較多。用ELISA測試屋塵和一些花粉的結果與RAST符合率較高，且與臨床也較符合，但與皮膚試驗的符合率可能不夠理想。

　　CAP吸咐變應原有單價，有多價，如多價霉菌，多價食物（Fx5E，含6種食物過敏原），多價羽毛等，多價變應原陽性后，再進一步確定單個變應原成分。目前國內應用較多。

　　三、抗血細胞抗體的檢測

　　血細胞抗體是Ⅱ型變態反應的主要介質，檢測抗血細胞抗體對Ⅱ型變態反應的診斷有重要的意義，具體方法和臨床分析參見臨床血液學和臨床基礎檢驗學以及凝集反應等有關章節。主要包括Rh抗體檢測、抗紅細胞、血小板、白細胞等。

　　四、循環免疫復合物的檢測

　　Ⅲ型超敏反應的發生主要是由循環免疫復合物（CIC）引起，通過檢測CIC可以證實某些疾病是否與Ⅲ型超敏反應有關，也可幫助分析判斷疾病的進程及轉歸。

　　（一）抗原特異性免疫復合物的檢測

　　抗原特異性免疫復合物的檢測是通過檢測免疫復合物中抗原特異性來檢測CIC.優點是特異性高，通過檢測可以了解引起免疫復合物病的抗原。但在大多數情況下，免疫復合物中的抗原性質不太清楚或非常復雜，所以抗原特異性方法并不常用。

　　（二）抗原非特異性免疫復合物的檢測

　　抗原非特異性免疫復合物的檢測僅是檢測血清中循環免疫復合物，方法很多。

　　（三）臨床意義

　　判定免疫復合物為發病機制的證據有三：①病變局部有IC沉積；②CIC水平顯著升高；③明確IC中的抗原性質。第三條證據有時很難查到，但至少要具備前兩條，單獨CIC的測定不足為憑。人體在健康狀態下也存在少量的CIC（大約l0～20μg／ml），其生理與病理的界限不易區分。另外，CIC檢測的方法太多，其原理各不相同，用一種方法測定為陽性，另一種方法檢測可能為陰性；但與免疫組化法一起檢測，其意義就大得多。

　　目前已經明確系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、部分腎小球腎炎和血管炎等疾病為免疫復合物病，CIC檢測對這些疾病仍是一種輔助診斷指標，對判斷疾病活動和治療效果也有一定意義。在發現紫癜、關節痛、蛋白尿、血管炎和漿膜炎等情況時，可考慮免疫復合物病的可能性，進行CIC和組織沉積IC的檢測。另外，患有惡性腫瘤時CIC檢出率也增高，但不出現Ⅲ型變態反應的損傷癥狀，稱之為臨床隱匿的IC病，然而這種狀態常與腫瘤的病情和預后相關。

　　五、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞計數

　　（一）嗜酸性粒細胞計數

　　嗜酸性粒細胞參與Ⅰ型變態反應，因此嗜酸性粒細胞增多可作為Ⅰ型變態反應的輔助診斷指標，而且可作為療效判定的指標之一。

　　嗜酸性粒細胞計數可用白細胞分類計數法，也可以用直接計數法，目前多采用后者。該類細胞的胞漿顆粒中富含堿性氨基酸和堿性蛋白，其等電點為pH11，因此呈嗜酸性，易與陰離子結合而被染色。常用的染色液含伊紅、石炭酸和福爾馬林，該溶液可溶解紅細胞和其他白細胞，增加背景的清晰度，使嗜酸性粒細胞易于識別。

　　（二）嗜堿性粒細胞計數

　　嗜堿性粒細胞亦參與Ⅰ型變態反應，其計數方法主要是直接計數法。嗜堿性粒細胞胞漿顆粒中肝素的硫酸根容易與陽離子染料結合而著色，現在常用的酸性染色液包括0.1íTA、阿利新藍、氯代十六烷基吡啶和氯化鑭等。該染液能使紅細胞和其他白細胞溶解，使嗜酸性粒細胞易于區別。外周血嗜堿性粒細胞數大于33／μl判為增高，大于50／μl為顯著增高。本試驗可作為Ⅰ型變態反應的篩選試驗，陽性率可達60%～70%；而且可作為療效考查的輔助指標。