1、范圍

　　本標準規定了血小板計數參考方法的技術要求。

　　本標準適用于建立血小板計數參考方法的實驗室。

　　2、規范性引用文件

　　國際血液學標準化委員會(ICSH)-2001血小板計數的參考方法

　　3、定義

　　參考方法(Referencemethod)

　　一種可清楚和準確描述的用于特定檢測的技術，該技術要有依據，可提供足夠準確和精密的實驗數據以評價其他實驗方法檢測結果的有效性。若有決定性方法，參考方法的準確性必須與決定性方法進行比較。參考方法應溯源至一級計量標準并且須標示不準確度和不精密度。

　　4、總則

　　4.1本標準采用間接法計數血小板(Platelet，PLT)。即用熒光標記PLT后，用流式細胞儀檢測紅細胞(Redbloodcell，RBC)和PLT的比值，同時用單通道阻抗原理的半自動細胞計數儀準確計數RBC，用RBC除以RBC和PLT的比值得出PLT的計數值。

　　4.2為了保證參考方法檢測結果的精密度和準確性，建立參考方法的實驗室必須進行比對。

　　5、血小板計數參考方法的原理

　　首先將EDTA抗凝血標本用無菌緩沖液進行預稀釋，再用特定的熒光抗體對PLT進行染色。溶液中已染色的血小板被稀釋成計數濃度，用流式細胞儀檢測血小板和紅細胞，根據熒光強度和散射光強度將閾值設在可從RBC中區分PLT的位置，以檢測出RBC和PLT的比值。用RBC的計數值除以RBC/PLT的比值計算出PLT計數值。

　　6、血標本

　　6.1用合乎要求的塑料注射器或真空采血系統采集健康人的靜脈血標本。

　　6.2標本的收集要求使用EDTA二鉀為抗凝劑，抗凝劑的濃度為3.7至5.4umol/ml血(1.5～2.2mg/ml血)。

　　6.3盛有標本的試管應有足夠的剩余空間以便于血標本的混勻操作。

　　6.4標本中不能有肉眼可見的溶血或小凝塊。

　　6.5標本置于18℃～22℃室溫條件下，取血后4小時之內完成檢測。

　　6.6為了保證RBC和PLT分布的均一性，在預稀釋和加標記抗體前動作輕柔地將采血管反復顛倒，充分混勻標本。勿使用混勻器對標本進行混勻。

　　7、容器和器皿

　　為避免血小板黏附于儲存容器或稀釋器皿上，在標本檢測的整個過程中必須使用聚丙烯或聚苯乙烯容器，不得使用玻璃容器和器皿。

　　8、儀器的性能

　　8.1使用流式細胞儀，通過前向角散射光和熒光強度來檢測PLT和RBC.儀器在檢測異硫氰酸熒光素標記的直徑為2μm的球形顆粒時必須有足夠的敏感度。

　　8.2用半自動、單通道、阻抗原理的細胞計數儀檢測RBC，儀器小孔管的直徑為80～100μm，小孔的長度為直徑的70%至100%，計數過程中吸入稀釋標本體積的準確度在1%以內(溯源至國家或國際計量標準)。

　　9、試劑

　　9.1稀釋液：用磷酸鹽緩沖液(PBS)作為稀釋液，濃度為0.01mol/L，pH值7.2～7.4，含0.1%的牛血清白蛋白(BSA)，配制方法如下：

　　9.1.1將1.15g無水磷酸氫二鈉(Na2HPO4;化學分析純，;分子量為142.0)加到約750ml去離子水或蒸餾水中并使之溶解。

　　9.1.2向210mg磷酸二氫鉀(KH2PO4;化學分析純，分子量為136.1)，8.0g氯化鈉(NaCl;化學分析純，分子量為58.44)，200mg氯化鉀(KCl;化學分析純，分子量為74.55)和1.0gBSA的混合物中加入去離子水或蒸餾水至1000ml.保存于4℃～8℃條件下。

　　9.1.3用低附著性的平均孔徑在0.20～0.25μm之間的濾膜過濾。

　　9.2染液：使用異硫氰酸熒光素標記的CD41和CD61抗體，這兩種抗體可以與血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復合物結合，用于檢測血小板。

　　實驗室應確認該批號抗體是否能得到足夠的染上熒光的血小板。抗體應能得到足夠高的血小板的熒光信號以便通過logFL1(528nm處的熒光強度)對logFS(前向角散射光)的圖形分析，將血小板從噪聲、碎片和RBC中分辨出來。

　　10、檢測過程

　　10.1用加樣器加5μl充分混勻(至少輕柔顛倒標本管8次)的血標本于100μl已過濾的PBS-BSA稀釋液中。

　　10.2加5μlCD41抗體和5μlCD61抗體染液，在室溫18℃～22℃、避光條件下放置15分鐘。

　　10.315分鐘后，加4.85mlPBS-BSA稀釋液制備成1：1000的稀釋標本，輕輕顛倒混勻以保證PLT和RBC充分混勻。

　　10.4用流式細胞儀檢測時，應至少檢測5000個信號，其中PLT應多于1000.流式細胞儀的設定必須保證每秒計數少于3000個信號。如果同時收集到RBC散射光的信號和血小板的熒光信號應被視為RBC-PLT重疊，計數結果將被分別計入RBC和PLT.

　　直方圖或點圖均可被采用，但推薦使用點圖。檢測過程中推薦使用正向置換移液器。

　　11、RBC濃度的計數法

　　據中華人民共和國衛生行業標準WS/TXXX-2003：紅細胞和白細胞計數的參考方法。

　　12、血小板計數值的確定

　　使用流式細胞儀確定RBC/PLT的比值

　　R=RBC/PLT

　　用RBC數除以R值得到PLT計數值

　　13、重疊

　　一旦設定了理想的檢測條件，則不須再次進行重疊計數的校準。

　　14不精密度

　　血小板檢測結果的不精密度(CV)要求≤3%。