蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、細菌毒素、酶、補體等皆為良好的可溶抗原。但因這些蛋白質(zhì)多為復雜的蛋白組分，免疫前需進行純化。蛋白質(zhì)純化方法在生物化學技術(shù)中已有詳述，本章主要介紹免疫化學純化方法。

　　(一)組織和細胞粗抗原的制備

　　免疫原多來源于只類及動物的組織或細胞，這些材料在取得可溶性蛋白質(zhì)之前，必須先進行處理，以適合于進一步純化。

　　1.組織細胞抗原的制備所用組織必須是新鮮的或低溫(<-40℃)保存的。器官或組織得到后立即去除表面的包膜或結(jié)締組織以及一些大血管。如有條件，臟器應進行灌注，除去血管內(nèi)殘留的血液。處理好的組織用0.05/NaN3生理鹽水洗去血跡及污染物。將洗凈的組織剪成小塊，進行粉碎。粉碎的方法有兩類：①高速組搗碎機法。操作時，將組織加鹽水(約1/2)裝入搗碎機筒內(nèi)，用高速(約1000r/min)間斷進行，每次30～60s，時間過長會產(chǎn)熱。②研磨法。可用玻璃勻漿器或乳缽研磨。玻璃勻漿器是由一內(nèi)壁經(jīng)過磨砂的玻璃管和一根一端為圓柱狀(表面亦經(jīng)磨砂)的磨桿組成，主要經(jīng)過旋轉(zhuǎn)、壓擠將組織粉粹。研磨法可用于韌性較大聽組織，如皮膚、空腔器官等。為了更有效地磨碎組織，有時在研磨時加入淘洗過的海砂。組織勻漿通過2000～3000r/min離心10min后分成兩個部分：沉淀物含有大量的組織細胞和碎片;上清液作為提取可溶性抗原的材料，提取前還要通過1000～2000r/min20～30min的高速離心，以除去微小的細胞碎片，此時上清液應澄清。

　　2.組織細胞或培養(yǎng)細胞可溶性抗原的制備制備抗原用的細胞包括正常細胞、病理細胞(如腫瘤細胞)或傳代細胞。組織細胞的制備一般通過上述機械破碎后取得。或通過酶消化，所用的酶大多為胃蛋白酶或胰酶。通過酶解將細胞間質(zhì)蛋白消化，獲得游離的單個細胞。細胞抗原一般分為三個組分：膜蛋白抗原、細胞漿抗原(主要為細胞器)和細胞核及核膜抗原。三種抗原的制備皆需將細胞破碎，方法有如下幾種。

　　(1)反復凍融法：將待破碎的細胞(有時為整塊組織)置-20冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后緩慢地融化。如此反復2次，大部分組織細胞及細胞內(nèi)的顆粒可被融破。

　　(2)冷熱交替法：在細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)及核酸時可用此法。操作時，將材料投入沸水浴中，90℃左右維持數(shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大部分細胞被破壞。

　　(3)超聲破碎法：對微生物和組織細胞多用此法。處理效果與樣品濃度和使用頻率有關(guān)。一般組織細胞皆易破碎，而細菌，尤其是真菌的厚膜孢子則較難打破。超聲波所使用的頻率從1～20kHz不等。同樣要間歇進行，因長時間超聲也會產(chǎn)熱，易導致抗原破壞。一次超聲1～2min，總時間為10～15min。

　　(4)自溶法：利用組織和微生物的自身酶系，在一定的pH和溫度下，使其細胞裂解。自溶的溫度，對動物組織細胞常選0～4℃，而對微生物常選室溫。自溶時常需加入少量防腐劑，如甲苯或氯仿等，NaN3不宜使用，因其能抑制酶的活力。

　　(5)溶菌酶處理法：在堿性條件下(pH8.0)，溶菌酶可專一破壞細菌細胞壁，適用于多種微生物。除溶菌酶外，蝸牛酶、纖維素酶等也可用于消化細菌和組織細胞。

　　(6)表面活性劑處理法：常用的有十二烷基吡啶、支氧膽酸鈉等。因效果較差，已少應用。

　　(二)超速離心和梯度密度離心法

　　超速離心是分離亞細胞及蛋白質(zhì)大分子的有效手段，往往是進一步純化的第一次過篩。超速離心又分差速離心和梯度離心。差速離心系指低速與高速離心交替進行，用于分離大小差別較大的顆粒。梯度密度離心是一種區(qū)帶分離法，通過梯度密度來維持重力的穩(wěn)定性。通過離心，沉淀的顆粒比液體的比重大，漂浮的顆粒比液體的比重小。通常待分離的懸液中的顆粒比液體重，假如要使之上浮，必須加入第三種成分，使其密度連續(xù)或不連續(xù)地升高，形成所謂梯度。第三種成分多用甘油、蔗糖、氯化銫或氯化銣等。假如梯度柱的范圍所表現(xiàn)的密度同待分離顆粒的密度大致相等時，則經(jīng)過較長時間離心可得到分離。這種方法稱為密度離心或梯度離心。

　　用超速離心或梯度離心分離和純化抗原只是一種根據(jù)抗原的比重特點分離的方法，除個別成分外，極難將某一抗原成分分離出來。目前僅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原物質(zhì)如載脂蛋白A、B等。對于大量的中、小分子量蛋白質(zhì)，多不適宜用超速及梯度密度離心作為純化手段。

　　(三)選擇性沉淀法

　　選擇性沉淀是采用各種沉淀劑或改變某些條件促使抗原成分沉淀，從而達到純化的目的。

　　1.核酸去除法從微生物或細胞提取蛋白質(zhì)抗原時，其中常含有大量核酸成分。除去核酸可用提取沉淀劑，如氯化錳、硫酸魚精蛋白或鏈霉素等。核糖核酸降解法較為簡便，用DNA或RNA酶與提取液共同作用30～60min(4℃)，即可有效地除去核酸成分。

　　2.鹽析沉淀法這是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分離動技術(shù)。由于方法簡便、有效、不損害抗原活性等優(yōu)點，至今仍被廣泛應用。

　　(1)抗原的粗篩：用不同飽和度的硫酸銨或硫酸鈉可將一個復雜的組織液吩成若干組分，也可收集某一飽和度的鹽析沉淀物作為進一步純化的粗篩物。最常用的鹽析劑是33%～50%飽和度的硫酸銨。

　　(2)提取丙種球蛋白：丙種球蛋白主要為IgG(95%以上)。將35%～40%飽和度的硫酸銨沉淀物經(jīng)去鹽后可直接用于某些試驗作為抗體試劑。此法簡單、穩(wěn)定、固收率高，已成為免疫化學試驗的常規(guī)方法。

　　(3)抗原的濃縮：在液體中含量較少的抗原，如尿中的游離輕鏈及離子交換層析洗脫液中的抗原，可通過加入硫酸銨，將其沉淀下來，以利進一步純化。

　　3.有機溶劑沉淀法有機溶劑以降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導致溶解度降低。另外，有機溶劑與水作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機溶劑中被沉淀析出。使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度的有機溶劑易引起蛋白質(zhì)變性、失活、操作必須在低溫下進行。Cohn(1942)低溫酒精沉淀法可將血漿蛋白分為5個組分，IgG屬于Cohn-3組分。

　　4.水溶性非離子型聚合物沉淀法常用的聚合物為聚乙二醇(PEG)及硫酸葡聚糖。水溶性聚合物沉淀蛋白質(zhì)的機制尚不清楚，大致有如下解釋：①聚合物與蛋白質(zhì)形成共沉物;①聚合物與蛋白質(zhì)之間發(fā)生水的重分配;①聚合物與蛋白質(zhì)形成復合物。此法受許多因素影響，主要是pH、離子強度、蛋白質(zhì)濃度和PEG的分子量等。分子量為2000～6000的PEG皆適宜于做蛋白沉淀用。如若使用得當，效果甚為滿意。一般認為，PEG濃度在3%～4%時沉淀免疫復合物，6%～7%可沉淀IgM，8%～12%可沉淀IgG，12%～15%可沉淀其他球蛋白，25%可沉淀白蛋白。最突出的應用是用3%～4%的PEG沉淀免疫復合物，未結(jié)合的抗原和抗體留在溶液中。按此原理設(shè)計了快速測定法和循環(huán)免疫復合物測定法。

　　(四)凝膠過濾和離子交換層析

　　凝膠過濾又名分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。離子交換層析是利用一些帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原，將蛋白質(zhì)抗原按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。這兩種層析如能共同應用或者反復應用其中的一種，皆可將某一蛋白質(zhì)從一復雜的組分中純化出來。

　　(五)親和層析

　　上面介紹的各種純方法主要是依賴抗原的物理和化學特性，如分子量、攜帶電荷等，經(jīng)過純化后只能取得相同性質(zhì)的物質(zhì)，在免疫特性上是否為同種物質(zhì)還不能肯定。親和層析是利用生物大分子的生物學特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計的層析技術(shù)。例如抗原和抗體、酶和酶抑制劑(或配體)、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結(jié)合成復合物。如果將復合物的一方固定在不溶性載體上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產(chǎn)生相當高的純化作用。另外，此法的優(yōu)點是迅速，有時僅一步即可達到純化的目的。

　　1.親和層析支持物的選擇作為親和層析支持物須符合以下要求：①非特異性吸附低;②液體通過時流速要快;③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定;④必須有合適的、豐富的化學基團，能有效地與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合;⑤必須帶有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。符合以上5個條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用的是瓊脂糖珠(Sepharose2B、4B、6B)。

　　2.配體的選擇所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體。良好的配體必須具備以下3個條件。

　　(1)抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。

　　(2)抗原與抗體之間必須有強的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇的性質(zhì)和數(shù)量。對抗體來說還決定于抗體來源動物的種類和免疫時間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高;免疫時間短的親和力低。但是，親和力太強也不利，因為解離抗原抗體復合物所需要的條件就要強烈，從而可造成蛋白質(zhì)的變性。例如用低pH(1.5～2.5)或高鹽(如6mol/L鹽酸胍)可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。

　　(3)配體必須有一個適當?shù)幕瘜W基團，這個基團不參與配體和大分子的特異結(jié)合，但可用來連接支持物，而且這種連接不應當影響配體與大分子結(jié)合的親和性。

　　3.抗原或抗體與支持物的結(jié)合將抗原或抗體結(jié)合到支持物上的方法目前有20多種，但可歸結(jié)為載體結(jié)合法、物理吸附法、交聯(lián)法和網(wǎng)絡(luò)法4類。

　　結(jié)合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團，然后將抗原或抗體連接到這些活化的基團上。用來發(fā)生交聯(lián)的化學反應必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交聯(lián)后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯(lián)的物質(zhì)。

　　最常用的支持物是Separose4B，將此支持物與溴化氰在pH11時進行處理，則能使支持物活化。此時溴化氰與支持物上的羥式反應形成氨基甲酸酯基團。加入溴化氰的量取決于支持物的量。如果希望取代程度提高，則加入溴化氰的量也要提高。交聯(lián)時首先要注意加入抗原或抗體的濃度。通常在交聯(lián)反應混合物中的交聯(lián)蛋白質(zhì)濃度應是親和分離濃度的20～30倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到200mg/ml凝膠。若希望最終產(chǎn)物含量較少，所加入的溴化氰也應減少。交聯(lián)時的pH也應注意，pH9.5～10時，活化的瓊脂糖珠很不穩(wěn)定。降低pH，也就減少了能反應的配體濃度，交聯(lián)量就會減少。

　　親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯(lián)，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結(jié)合，產(chǎn)生了所謂的無效吸附。另外，Sepharose4B交聯(lián)時要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯(lián)。基于這兩個原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長度的“手臂”。必要時這些“手臂”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯(lián)。常用的帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖(二亞胺)、羧基瓊脂糖(琥珀酸酐)、溴乙酰瓊脂糖(0-溴乙酰-N-羧基琥珀酰胺)、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。這些帶“手臂”的瓊脂糖有商品供應，使用極為方便。

　　4.親和層析條件的選擇

　　(1)支持物與抗原或抗體結(jié)合后，還可能有多余的活性基團，為了封閉這些殘基團，必須用無關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團。

　　(2)去掉未結(jié)合及結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。先用0.2mol/LNaHCO2(含0.1mol/LNaC1，pH9.0)洗脫2～3個柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。

　　(3)解脫劑有多種。常用的有0.2mol/LpH2.8甘氨酸-HC1緩沖液、0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液、7mol/L脲、5mol/LNaI、3mol/L硫氰酸鉀(或鈉)、1mol/L乙酸、6mol/L鹽酸胍、0.2mol/LKC1等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是3mol/L硫氰酸鉀(或鈉)及0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液。

　　(六)免疫球蛋白片段的制備

　　免疫球蛋白具有抗原性，可用以免疫動物制備相應的抗體，而這種抗體常用于免疫球蛋白的檢測。五類免疫球蛋白皆可用前面介紹的純化方法提取出來。如將這些免疫球蛋白分解成片段，如Fc段、Fab段、輕鏈等作為免疫原制備抗血清，則可制得分辨能力更高的特異性抗體。制備方法如下：

　　1.溫和條件析離亞單位亞單位之間以非共價鍵、如氫鍵、靜電引力等連接起來，這些鍵結(jié)合力較弱，可經(jīng)2種方法將其斷開制備片段。第一種方法是改變pH，一般將pH調(diào)至3～4(羧基滴定范圍)和9～10(賴氨酸-酪氨酸滴定范圍)，當?shù)陀?或高于10時，亞單位會離解。這個方法是利用強變性劑，如8mol/L鹽酸胍等。用此可以將亞單位分開。這個方法也用于載脂蛋白抗原的解離和膠原肽的提取。

　　2.二硫鍵的解離二硫鍵是連接Ig肽鏈的共價鍵，解離二硫鍵可將輕鏈與重鏈分開。解離的方法多采用氧化法和還原法。氧化法的優(yōu)點是切開后，肽鏈不能重新形成二硫鍵，便于肽鏈純化;缺點是甲硫氨酸被氧化成亞砜，色氨酸側(cè)鏈被破壞。還原法是將二硫鍵還原成巰基。但這個疏基極不穩(wěn)定，易再重新結(jié)合成二硫鍵，必須及時用碘乙酸或碘代乙酰胺進行羧甲基化。

　　3.溴化氰裂解法溴化氰與蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸側(cè)鏈的硫醚基起反應，生成溴化亞氨內(nèi)酯。此產(chǎn)物與水反應，將肽鏈斷裂。

　　4.酶裂解法因為酶解有極好的專一性，不同的片段可用不同的酶裂解。如木瓜酶可將IgG裂解成Fc和Fab(×2)3個片段，胃蛋白酶可將IgG解成F(ab')2和幾個小肽段，胰蛋白酶則將其切成不規(guī)則的肽鏈。作為抗原制備常用木瓜酶切斷，取得Fc段，以制備抗鏈血清。作為抗體試劑應用，常用胃蛋白酶切斷取得F(ab')2。

　　(七)純化抗原的鑒定

　　純化抗原的鑒定方法較多，常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳法、結(jié)晶法、免疫電泳法、免疫雙擴散法等。事實上，僅用一種方法還無法作純度鑒定，只有幾種方法聯(lián)合應用才較可靠。結(jié)晶法不是純度的標準，因結(jié)晶中往往含有其它成分。電泳譜中呈現(xiàn)單一區(qū)帶也不能排除在這條帶中含有其他成分。有時雖出現(xiàn)幾條帶，也可能是同一物質(zhì)的聚合體或降解物。

　　蛋白抗原的定量可用生化分析中的常用方法。根據(jù)測試抗原量的多少可用雙縮脲法或酚試劑法。如果抗原極為寶貴，可用紫外光吸收法。