一、斑點(diǎn)-ELISA

　　斑點(diǎn)-ELISA(dot-ELISA)的特點(diǎn)時(shí)：①以吸附蛋白質(zhì)能力很強(qiáng)的硝酸纖維素膜為固相載體;②底物經(jīng)酶反應(yīng)后形成有色沉淀，使固相膜染色。在實(shí)驗(yàn)室中斑點(diǎn)-ELISA可按下法進(jìn)行。在硝酸纖維膜上用鉛筆劃成4mm×4mm的小格，在每格中央點(diǎn)加抗原1～2μl，成為一個(gè)小點(diǎn)。干燥后將每格剪下分別放入ELISA板孔中，按ELISA方法操作，最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物，如在膜上出現(xiàn)染色斑點(diǎn)，即為陽(yáng)性反應(yīng)。因硝酸纖維素膜吸附性能強(qiáng)，一般在包被后須再進(jìn)行封閉。如將硝酸纖維素膜裁剪成膜條，并在同一張膜條上點(diǎn)有多種抗原，將整個(gè)膜條與同一份血清反應(yīng)，則可同時(shí)獲得對(duì)多種疾病的診斷結(jié)果。斑點(diǎn)-ELISA的缺點(diǎn)是操作麻煩，特別是洗滌的操作很不方便。

　　應(yīng)用斑點(diǎn)-ELISA的原理，通過(guò)特殊工藝已制備出各種試劑，供臨床檢驗(yàn)用。一般分三種類型：①將試劑膜粘貼在塑料條片，便于洗滌和觀察。②將試劑膜封在小盒內(nèi)，膜下墊吸水劑，洗滌液通過(guò)膜吸入盒內(nèi)。此即斑點(diǎn)免疫滲濾試驗(yàn)(見(jiàn)第十九章)。③將試劑膜固定在小杠框格中放入特殊的自動(dòng)分析儀中檢測(cè)。應(yīng)用這一系統(tǒng)可做各種蛋白質(zhì)、激素、藥物和抗生素的定量測(cè)定。

　　二、免疫印跡法

　　免疫印跡法(immunoblottingtest，IBT)亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(enzymelinkedimmunoelectrotransferblot，EITB)，因與Southern早先建立的檢測(cè)核酸的印跡方法Southernblot相類似，亦被稱為Westernblot。免疫印跡法分三個(gè)階段進(jìn)行。第一階段為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽(yáng)泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)(只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶)。第二階段為電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓(100V)和大電流(1～2A)，通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此分階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜(相當(dāng)于包被了抗原的固相載體)依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(呈棕色)和4-氯-1-萘酚(呈藍(lán)紫色)。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDA-PAGE加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個(gè)有效的分析手段，不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗(yàn)。抗原經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標(biāo)抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實(shí)驗(yàn)室中供檢測(cè)用。根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可判斷有無(wú)針對(duì)病毒的特異性抗體。

　　三、重組免疫結(jié)合試驗(yàn)

　　重組免疫結(jié)合試驗(yàn)(recombinantimmunlbindingassay，RIBA)是與免疫印跡法的方法，不同之處在于特異性抗原不通過(guò)電泳分離轉(zhuǎn)印，而是直接分條加在固相膜上。RIBA已用于血清抗HCV抗體的測(cè)定和分析。HCV抗原成分復(fù)雜，包括有特異性的非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原、結(jié)構(gòu)區(qū)抗原、核心抗原和非特異性的G抗原。在ELISA中一般使用混合抗原包被，檢測(cè)到的血清抗體是綜合性的。RIBA將各種抗原成分以橫線條式分別吸附在硝酸纖維素膜的膜條上，放于特制的長(zhǎng)條凹槽反應(yīng)盤中與標(biāo)本(一抗)和酶標(biāo)二抗溫育和洗滌，最終加底物顯色后，顯色條帶提示血清中存在有針對(duì)這一吸附抗原的特異性抗體。根據(jù)條帶的粗細(xì)和顯色深淺，還可粗略估計(jì)抗體效價(jià)。

　　RIBA十分適合于含復(fù)雜抗原成分的病原體抗體的分析，除抗HCV外，也成功地用于抗HIV抗本的測(cè)定。