要使ELISA測(cè)定得到準(zhǔn)確的結(jié)果，不論是定性的還是定量的，必須嚴(yán)格按照規(guī)定的方法制備試劑和實(shí)施測(cè)定。主要試劑的制備要點(diǎn)已如前述，其他一般性試劑，如包被緩沖液、洗滌液、標(biāo)本稀釋液、結(jié)合物稀釋液、底物工作液和酶反應(yīng)終止液等，配制時(shí)不可掉以輕心。緩沖液可于冰箱中短期保存，使用前應(yīng)觀察是否變質(zhì)。蒸餾水的質(zhì)量在ELISA中也至關(guān)重要，最好使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。

　　測(cè)定的實(shí)施中，應(yīng)力求各個(gè)步驟操作的標(biāo)準(zhǔn)化，下面以板式ELISA為例，介紹有關(guān)注意事項(xiàng)。

　　(一)加樣

　　在ELISA中除了包被外，一般需進(jìn)行45加樣。在定性測(cè)定中有時(shí)不強(qiáng)調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時(shí)應(yīng)該使用相同口徑的滴管，保持準(zhǔn)確的加樣姿勢(shì)，使每滴液體的體積基本相同。在定量測(cè)定中則加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制。加樣時(shí)應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。

　　(二)保溫

　　在ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，此時(shí)反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)�板平放在底部墊有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時(shí)更為重要。加入底物后，反應(yīng)的時(shí)間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，以便不時(shí)觀察，待對(duì)照管顯色適當(dāng)時(shí)，即可終止酶反應(yīng)。

　　(三)洗滌

　　洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)聚，但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA測(cè)定的反應(yīng)過程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯(吐溫，Tween)一類物質(zhì)即右達(dá)到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對(duì)聚山梨酯編號(hào)，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯20，在ELISA中最為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。

　　洗滌如不徹底，特別在最后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)抗體作用而產(chǎn)生干擾。

　　ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液;②將洗滌液注滿板孔;③放置2min，略作搖動(dòng);④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為3～4次，有時(shí)甚至需洗5～6次。

　　(四)比色

　　如陰性對(duì)照顏色極淺，在定性測(cè)定中一般可采用目視比色。如用比色計(jì)測(cè)定結(jié)果，準(zhǔn)確性決定于ELISA板底的平整與透明度和比色計(jì)的質(zhì)量。