(一)病毒的分離

　　病毒分離的一般程序是：

　　無菌標本(腦脊液、血液、血漿、血清)可直接接種細胞、動物、雞胚;無菌組織塊經(jīng)培養(yǎng)液洗液洗滌后制成10～20%懸液離心后，取上清接種;咽洗液、糞便、尿、感染組織或昆蟲等污染標本在接種前先用抗生素處理，殺死雜菌。

　　1.細胞培養(yǎng) 用分散的活細胞培養(yǎng)稱細胞培養(yǎng)(Cell culture)。所用培養(yǎng)液是含血清(通常為胎牛血清)、葡萄糖、氨基酸、維生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。細胞培養(yǎng)適于絕大多數(shù)病毒生長，是病毒實驗室的常規(guī)技術(shù)。

　　原代細胞培養(yǎng)(Primary cell culture)用胰蛋白酶將人胚(或動物)組織分散成單細胞，加一定培養(yǎng)液，37℃孵育1-2天后逐漸在培養(yǎng)瓶底部長成單層細胞，如人胚腎細胞、兔腎細胞。原代細胞均為二倍體細胞，可用于產(chǎn)生病毒疫苗，如兔腎細胞生產(chǎn)風疹疫苗，雞成纖維細胞產(chǎn)生麻疹疫苗，猴腎細胞生產(chǎn)脊液灰質(zhì)炎疫苗。因原代細胞不能持續(xù)傳代培養(yǎng)，故不便用于診斷工作。

　　二倍體細胞培養(yǎng)(Diploid cell cultune)原代細胞只能傳2-3代細胞就退化，在多數(shù)細胞退化時，少數(shù)細胞能繼續(xù)傳下來，且保持染色體數(shù)為二倍體，稱為二倍體細胞。二倍體細胞生長迅速，并可傳50代保持二倍體特征，通常是胚胎組織的成纖維細胞(如WI-38細胞系)。二倍體細胞一經(jīng)建立，應(yīng)盡早將細胞懸浮于10%二甲基亞砜中，大量分裝安瓿貯存于液氮(-196℃)內(nèi)，做為“種子”，供以后傳代用。目前多用二倍體細胞系制備病毒疫苗，也用于病毒的實驗室診斷工作。

　　傳代細胞培養(yǎng) (Continous cell culture)通常是由癌細胞或二倍體細胞突變而來(如 Hela 、Hep-2、 Vero細胞系等)，染色體數(shù)為非整倍體，細胞生長迅速，可無限傳代，在液氮中能長期保存。目前廣泛用于病毒的實驗室診斷工作，根據(jù)病毒對細胞的親嗜性，選擇敏感的細胞系使用。

　　表23-3 病毒增殖用部分細胞系及來源

　　淋巴細胞培養(yǎng)(Lymphocyte culture)正常成熟的淋巴細胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。然而EBV感染的B淋巴細胞卻能在體外持續(xù)傳代，這是病毒轉(zhuǎn)化細胞的例證，也是分離出EBV的標志。T淋巴細胞在加入T細胞生長因子(IL-2)后可在體外培養(yǎng)，為研究人類逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV、HTLV)提供了條件，HIV在T淋巴細胞培養(yǎng)物中增殖形成多核巨細胞。

　　2.動物試驗這是最原始的病毒分離培養(yǎng)方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據(jù)各病毒對組織的親嗜性而定，可接種鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、腹腔或靜脈，例如嗜神經(jīng)病毒(腦炎病毒)接種鼠腦內(nèi)，柯薩奇病毒接種乳鼠(一周齡)腹腔或腦內(nèi)。接種后逐日觀察實驗動物發(fā)病情況，如有死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續(xù)傳代，并作鑒定。

　　3.雞胚培養(yǎng)用受精孵化的活雞胚培養(yǎng)病毒比用動物更加經(jīng)濟簡便。根據(jù)病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內(nèi)或靜脈內(nèi)，如有病毒增殖，則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養(yǎng);但很多病毒在雞胚中不生長。

　　(二)分離病毒的鑒定

　　1.病毒在細胞內(nèi)增殖的指征

　　(1)細胞致病作用(Cytopathogeniceffect,CPE)病毒在細胞內(nèi)增殖引起細胞退形性變，表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測性診斷(表23-4)。免疫熒光(IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點，細胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。

　　表23-4 病毒在細胞內(nèi)增殖的指征

　　(2)紅細胞吸附現(xiàn)象(Hemadsorptionphenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染細胞后24-48小時，以細胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細胞，發(fā)生紅細胞吸附現(xiàn)象。若加入相應(yīng)的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生，稱為紅細胞吸附抑制試驗。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。

　　(3)干擾現(xiàn)象(Interference phenomenon)一種病毒感染細胞后可以干擾另一種病毒在該細胞中的增殖，這種現(xiàn)象叫干擾現(xiàn)象。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒(如風疹病毒)但能干擾以后進入的病毒(如ECHO病毒)增殖，使后者進入宿主細胞不再生產(chǎn)CPE。

　　2.病毒感染性的定量測定

　　空斑形成單位 (Plaque-forming unit ,PFU)測定這是一種測定病毒感染性比較準確的方法。將適當濃度的病毒懸液接種到生長單層細胞的玻璃平皿或扁瓶中，當病毒吸附于細胞上后，再在其上復(fù)蓋一層溶化的半固體營養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。當病毒在細胞內(nèi)復(fù)制增殖后，每一個感染性病毒顆粒在單層細胞中產(chǎn)生一個局限性的感染細胞病灶，病灶逐漸擴大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中顯出沒有著色的“空斑”，清楚可見。由于每個空斑由單個病毒顆粒復(fù)制形成，所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位(PFU)來表示。

　　(2)50%致死量(LD50)或50%組織細胞感染量(TCID50)的測定本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)后，引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時間后，觀察細胞或雞胚病變，如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方法計算出50%感染量或50%組織細胞感染量，可獲得比較準確的病毒感染性滴度。

　　3.病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。

　　4.血清學(xué)鑒定用已知的診斷血清來鑒定。補體結(jié)合試驗可鑒定病毒科屬;中和試驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀，檢材來源及流行季節(jié)等加以綜合分析，并應(yīng)注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆，須用病人急性期與恢復(fù)期雙份血清作血清學(xué)試驗，血清抗體滴度有≥4倍以上增高，才有意義。