⑤溫度與時間的影響：一般室溫或30℃恒溫條件下顯色。中國藥典多數25℃暗處反應40～45min. 4.異煙肼比色法甾體激素C3-酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性條件下與羰基試劑異煙肼縮合形成黃色異煙腙，在一定波長下具有最大吸收。

    某些具有兩個酮基的甾體激素可形成雙腙，如黃體酮、可的松和氫化可的松等。

    本法主要用于甾體激素制劑的測定，如倍他米松軟膏、哈西奈德軟膏、倍他米松磷酸鈉及其注射液等的含量測定。

    討論：①溶劑的選擇：只用用無水乙醇和無水甲醇才能得到滿意的結果，其他溶劑因受到異煙肼鹽酸鹽在其中溶解度的限制不能采用。

    ②酸的種類和濃度以及異煙肼的濃度：當酸與異煙肼試劑的摩爾比為2：1時可獲得最大吸收度。

    ③水分、溫度、光線和氧的影響：當溶劑中含水量增高，吸收度隨之降低。溫度升高，反應加速。當在具塞玻管中不致使溶劑揮發及吸收水分的情況下，光與氧不影響反應。

    ④關于反應的專屬性：具有Δ4-3-酮基的甾體激素在室溫不到1h即可定量地與酸性異煙肼反應。其他甾酮化合物需在長時間放置或加熱后方可反應完全，因此在上述反應條件下，本法對Δ4-3-酮甾體具有一定的專屬性。

    5.Kober反應比色法Kober反應是指雌激素與硫酸-乙醇共熱呈色，用水或稀硫酸稀釋后重新加熱發生顏色改變，并在515nm附近有最大吸收。

    Kober反應有兩步：①與硫酸-乙醇光熱產生黃色，在465nm處有最大吸收；②加水或稀硫酸稀釋，重新加熱顯桃紅色，在515nm處有最大吸收。

    中國藥典采用本法測定炔雌醇片及復方炔諾孕酮片、復方炔諾孕酮滴丸、復方左炔諾孕酮滴丸中的炔雌醇的含量。

    維生素類藥物維生素A維生素A的結構為具有一個共軛多烯側鏈的環己烯，因而具有許多立體異構體。

    天然維生素A主要是全反式維生素A.性質：具紫外吸收，易氧化變質，能與三氯化銻呈色，與氯仿、乙醚、環己烷或是由醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。

    鑒別試驗①三氯化銻反應（Carr-price反應）：維生素A在飽和無水三氯化銻的無醇氯仿溶液中，即顯藍色，漸變成紫紅色。

    ②紫外吸收光譜：維生素A分子中含有5個共軛雙鍵，其無水乙醇溶液在波長326nm處有最大吸收。當在演算催化下加熱，則發生去水反應而生成脫水維生素A.后者比維生素A多一個共軛雙鍵，使其最大吸收峰紅移，同時在350～390nm波長范圍內出現3個最大吸收峰。

    ③薄層色譜：以硅膠G為吸附劑，環己烷-乙醚（80：20）為流動相。

    含量測定：紫外分光光度法（三點校正法）

    原理：本法是在三個波長處測定吸收度，根據校正公式計算吸收度A校正值后，再計算含量，故本法亦稱“三點校正法”。原理如下：

    ①雜質的吸收在310～340nm波長范圍內呈一條直線，且隨波長的增大，吸收度變小。

    ②物質對光的吸收具有加和性。

    三點波長的選擇法①第1點：選擇維生素A的最大吸收波長（即λ1）。

    ②第2點和第3點：在最大吸收波長的兩側各選一點（即λ2和λ3）。

    等波長差法：在λ1的左右各選一點為λ2和λ3，使λ3—λ1＝λ1—λ2.維生素A醋酸酯。

    等吸收法：在λ1的左右各選一點為λ2和λ3，使Aλ2= Aλ3=6/7 Aλ1.維生素A醇。

    ③雜質吸收：對維生素A的測定有影響的雜質主要有：

    維生素A2和維生素A3；維生素A的氧化產物（環氧化物、維生素A醛和維生素A酸）；維生素A在光照下產生的無生物活性的聚合物鯨醇；維生素A