確定氧化磷酸化偶聯部位通常用兩種方法。

　　(一)P/0值測定

　　P/0值指在氧化磷酸化過程中消耗一克原子氧所消耗的無機磷的克原子數，或者說消耗一克原子氧所生成的ATP的克分子數。P/0值實質上指的是呼吸過程中磷酸化的效率。

　　測定P/0值的方法通常是在一密閉的容器中加入氧化的底物、ADP、Pi、氧飽和的緩沖液，再加入線粒體制劑時就會有氧化磷酸化進行。反應終了時測定O2消耗量(可用氧電極法)和Pi消耗量(或ATP生成量)就可以計算出P/0值了。在反應系統中加入不同的底物，可測得各自的P/0值，結合我們所了解的呼吸鏈的傳遞順序，就可以分析出大致的偶聯部位了。

　　表6-3　離體線粒體的P/0比值

　　從上表可以看出P/0值為小數，由于線粒體的偶聯作用在離體條件下不能完全發揮，故可認為實際的ATP生成數是他們所接近的正整數值。

　　比較表中的(1)和(2)，呼吸鏈傳遞的差異是在CoQ之間，兩者ATP的生成數相差1，所以這個ATP的生成部位一定在NAD→CoQ之間。

　　比較表中(2)和(3)，呼吸鏈傳遞的差異是在Cyt c之間，兩者ATP的生成數相差1，所以這個ATP的生成部位在CoQ→Cyt c之間。

　　比較表中(3)和(4)，生成的ATP數均為1，呼吸鏈傳遞的區別是在Cyt c→Cyt aa3，故Cytc→ aa3不存在偶聯部位，而在Cyt aa3→O2之間存在著一個偶聯部位。

　　(二)根據氧化還原電位計算電子傳遞釋放的能量是否能滿足ATP合成的需要

　　氧化還原反應中釋放的自由能△G'O與反應底物和產物標準氧化還原電位差值(△E'O)之間存在下述關系：△G'O=�瞡F△E'O

　　式中n為氧化還原反應中電子轉移數目，F為法拉弟常數(23.062千卡/克分子·伏特，或96500庫侖/克分子)。

　　一克分子ATP水解生成ADP與Pi所釋放的能量為7.3千卡，凡氧化過程中釋放的能量大于7.3千，均有可能生成一克分子ATP，就是說可能存在有一個偶聯部位，根據上式計算，當n=2時，△E'O=0.1583V時可釋放7.3千卡能量，所以反應底物與生成物的標準氧化還原電位的變化大于0.1583V的部位均可能存在著一個偶聯部位。

　　從圖6-11可以看出，在NAD→CoQ,Cyt b→Cyt c和Cyt aa3→O2處可能存在著偶聯部位。必須明確，這種計算的基礎是反應處在熱力學平衡狀態，溫度為25℃，pH為7.0，反應底物和產物的濃度均為1克分子，這種條件在體內是不存在的。