2012臨床執業醫師微生物學輔導：細菌感染的診斷

　　一、檢測細菌或其抗原

　　(一)直接涂片顯微鏡檢查

　　自病人標本直接涂片作染色鏡檢是簡便而快速的方法之一。自一定部位采集標本作直接檢查需考慮細菌的形態特征與可能存在的細菌數量。腦膜炎患者的腦脊液和瘀斑刺破涂片，常可顯示在細胞內的革蘭氏陰性腎形雙球菌，有診斷價值。白喉患者咽部假膜涂片中可見典型的桿菌有時可有異染顆粒，也有參考診斷價值。結核患者痰直接或濃集后，涂片抗酸染色檢出結核桿菌有診斷價值。在少數情況下，也有利用免疫熒光或酶標記抗體染色鏡檢方法進行快速診斷，如糞例中的霍亂弧菌、痢疾桿菌等，可用這種技術檢出。

　　(二)培養

　　大多數病菌的形態與染色并無特征，因此需用培養方法來分離與鑒定細菌。雖然這一方法需要的時間較長，但比較可靠。此外，只有通過這一方法才能獲得細菌的純培養，可用于做藥敏試驗或毒力試驗。應根據不同細菌需要的營養、生長條件(如厭氧或CO2)、菌落生長特征來初步識別細菌。如溶血性鏈球菌需在血瓊脂平板上生長，菌落小而透明，菌落周圍有完全溶血圈，可資鑒別。多數細菌欲確定為何種病原菌尚需進一步獲得純培養及接種各種特殊培養基進行生化反應試驗或確定其抗原性與致病力等。

　　(三)生化反應

　　細菌的合成與分解代謝過程中，能通過酶利用一些物質或分解一些物質。不同的細菌具有不同的酶，因此各種細菌能夠利用與分解的物質也各不相同。利用各種細菌的不同生化反應幫助鑒別細菌在某些細菌如腸道桿菌中是很重要的步驟。例如腸道桿菌均為革蘭氏陰性桿菌。菌落形態亦相似，但對于糖的發酵結果不同，因此可利用不同種糖作為培養基質進行生化反應予以區別。

　　(四)抗原檢測與分析

　　有些細菌即使用生化反應變難區別，但其細菌抗原成份(包括菌體抗原、鞭毛抗原)卻不同。利用已知的特異抗體測定有無相應的細菌抗原可以確定菌種或菌型。常用的方法為玻片凝集反應，用已知的特異免疫血清與待鑒定的細菌在玻片上做凝集反應，如出現凝集菌團則為陽性，說明該菌有相應的特異抗原。近年采用了各種檢測抗原的敏感方法，如對流免疫電泳、放射免疫、酶免疫、氣相色譜等方法，試圖直接從患者標本中檢測細菌抗原作快速診斷。如果在細菌性腦膜炎中，利用對流免疫電泳在腦脊液中可分別檢測肺炎球菌、腦膜炎球菌及流感桿菌，特異性高，敏感性亦高。氣相色譜方法系列利用細菌代謝產生的揮發性短鏈有機酸，進行氣相色譜分析可鑒別細菌，這在厭氧菌中應用很廣。檢測抗原的另一優點為在應用了抗生素治療后，細菌生長被抑制，利用培養方法不能檢出的細菌，因尚有抗原存在，在短期內仍可被檢出，從而有助于明確病因。個別情況下還可利用噬菌體對細菌抗原型別分析，用于流行病學追蹤調查。

　　二、檢測抗體

　　人體受病菌感染后，經一定時間產生抗體，抗體的量隨病菌感染過程而增多，表現為效價升高。因此用已知的細菌或抗原檢測患者體液(主要為血清)中有無相應抗體及抗體量的動態變化，可輻助診斷。一般采用血清進行試驗，故又稱為血清學試驗。血清學試驗適用于抗原性較強的病原菌及病程較長的傳染病診斷。

　　正常人如已經受過某些病原菌隱性感染或近期進行過預防接種，血清中可能含有對該種病原菌的一定量的抗體，因此必須有抗體效價升高或隨病程遞增才有參考價值。例如傷寒患者血清抗體的檢查稱為肥達氏試驗(Widal test，即將患者血清不同稀釋后，與傷寒、副傷寒菌抗原在試管中做凝集反應。根據最高血清稀釋度仍有明顯凝集的血清抗體效價，結合患者具體情況作為診斷。多數血清學試驗的診斷需取患者雙份血清，即一份在疾病的急性期，另一份在恢復期(一般為2～6周后)，當抗體效價升高4倍以上方有診斷價值。因此血清學診斷主要為病后的回顧性診斷。但目前有利用檢測某些細菌某些細菌特lgM抗體的早期診斷方法。此外，在檢測測抗體時至少應有懷疑可能致病細菌的線索方可采用相應抗原，否則就無從選擇做何種血清學試驗。有些患者因早期使用抗生素治療，細菌在體內繁殖不多，患者可不產生抗體，因而并非每一患者均有抗體效價升高的表現。然而當病原菌未能被檢出時，有些患者仍可通過血清抗本效價的升高予以診斷，因此檢測細菌是互相輔助的診斷方法。

　　三、檢測細菌遺傳物質

　　通過檢測病原體遺傳物質來確認病原體也許是檢查病原體為直接的方法了。目前比較成熟的技術包括基因探針技術和PCR技術。

　　(一)基因探針技術

　　用標記物標記細菌染色體或質粒DNA上的特異性片段制備成細菌探針，待檢標本經過短時間培養后，經過點膜、裂解變性、預雜交和雜交后，利用探針上標記物發出的信號可以知道雜交結果并判斷病原體的性質。基因探針技術操作比較復雜，加之同位素污染等問題，目前尚不能普及應用。近年來發展起來的地高辛標記的非同位素探針，從探針標記到雜交都很方便，只是價格昂貴，仍限于科研應用，尚不能普及。

　　(二)PCR技術

　　這是八十年代末發展起來的一項極有應用價值的技術，設計病原體基因的特異引物，細菌標本(不經培養)經過簡單裂解、變性后，就可在PCR儀上進行擴增反應，經過25～30個循環，通過瓊脂糖電泳即可觀察擴增結果，檢出病原體。這種技術的特點是簡便、快速。它尤其適于那些培養時間較長的病原菌的檢查，如結核桿菌、支原體等。PCR高度的敏感性使該技術在病原體診斷過程中極易出現假陽性，避免污染是提高PCR診斷準確性的關鍵環節。

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