第五節　結構測定

　　苷是由糖和苷元兩部分組成的。

　　苷的分解，首先了解基本的分子量的大小，就把苷通過水解的辦法變成兩部分，變成苷元部分、糖部分，然后分別對苷元部分、糖部分分別來進行結構研究，最后將兩部分結構，拼揍在一起，還原成一個苷的完整的結構。

　　一、糖的鑒定

　　(一)紙色譜

　　展開劑以正丁醇-乙醇-水和水飽和的苯酚兩種系統應用最為普遍。正丁醇醋酸水簡稱BAW系統，B代表正丁醇，A代表醋酸，W代表水。比例為4:1:5的上層溶液。糖類的紙色譜常用顯色劑有：硝酸銀試劑;三苯四氮唑鹽試劑;苯胺-鄰苯二甲酸鹽試劑;3,5-二羥基甲苯-鹽酸試劑;過碘酸加聯苯胺試劑等。

　　在用紙層吸來進行分離，最常見的糖是葡萄糖和鼠李糖，這兩個糖Rf值的大小一般的規律是，鼠李糖因為極性，小于葡萄糖，在用紙色譜檢識時，鼠李糖的Rf值一般大于葡萄糖。不同的糖Rf值的大小都會有比較大的差別。

　　常用顯色劑有：硝酸銀試劑，使還原糖顯棕黑色;三苯四氮唑鹽試劑，使單糖和還原性低聚糖呈紅色;苯胺-鄰苯二甲酸鹽試劑，使單糖中的五碳糖和六碳糖所呈顏色略有區別;3，5-二羥基甲苯-鹽酸試劑，使酮糖和含酮糖的低聚糖呈紅色;過碘酸加聯苯胺，使糖、苷和多元醇中有鄰羥基結構者呈藍底白邊。

　　(二)薄層色譜

　　糖的極性大，在硅膠薄層上進行層析時，點樣量不宜過多。若點樣太多，斑點就會明顯拖尾，Rf值也下降，使一些Rf值相近的糖難以獲得滿意的分離。若硅膠用0.03mol/L硼酸溶液或一些無機鹽的水溶液代替水調制吸附劑涂鋪薄層，則樣品承載量可明顯增加，分離效果也有改善。

　　(三)氣相色譜

　　(四)離子交換色譜

　　(五)液相色譜

　　二、糖鏈的結構測定

　　測定糖鏈的結構主要解決三個問題：單糖的組成;糖與糖的連接位置和順序;苷鍵的構型。

　　(一)分子量的測定　苷的分子量測定目前大多采用質譜法。但由于其極性大導致熱揮發性差，電子轟擊法(EI)和化學電離(CI)常不能得到理想的結果，一般采用場解吸(FD)、快原子轟擊(FAB)、電噴霧(ESI)等方法獲得[M+H]+、[M+Na]+等準分子離子峰。

　　(二)單糖的鑒定　苷中糖鏈的研究首先要了解由哪些單糖所組成，各種單糖之間的比例如何。一般是將苷鍵全部酸水解，然后用紙色譜檢出單糖的種類。經顯色后用薄層掃描儀求得各種糖的分子比。單糖的定性定量也可以通過苷全甲基化并水解后得到的甲基化單糖的氣相色譜決定，但需要各種各樣的甲基化單糖作標準品。

　　(三)單糖之間連接位置的確定

　　單糖之間連接位置的確定的兩種方法是：苷全甲基化甲醇解，13CNMR苷化位移。

　　將苷全甲基化，然后水解苷鍵，鑒定所有獲得的甲基化單糖，其中游離的一OH的部位就是連接位置。水解要盡可能溫和，否則會發生去甲基化反應和降解反應。

　　(四)糖鏈連接順序的確定

　　早期決定糖連接順序的方法主要是緩和水解法，即用稀酸(包括有機酸)水解、酶解、乙酰解、堿水解等方法，將苷的糖鏈水解成較小的片段(各種低聚糖)，然后分析這些低聚糖的連接順序，從低聚糖的結構推測整個糖鏈的結構。Smith裂解法也廣泛用于糖連接順序的決定，只是分析碎片的工作比較繁瑣。

　　近年質譜分析也已用于糖鏈連接順序的研究。在快原子轟擊質譜(FABMS)中有時會出現苷分子中依次脫去末端糖的碎片離子峰。如果單糖的質量不同，可由此確定糖的連接順序。

　　目前，2D-NMR和NOE差譜技術在確定糖鏈連接位置和順序的研究中有了廣泛的應用。如在以下化合物HMBC譜中可以觀察到1″-H和7-C，1′″-H和3″-C以及l″″-H和6″′-C的遠程相關，由此可判斷糖與苷元及單糖之間的連接順序。

　　(五)苷健構型的確定

　　糖與糖之間的苷鍵和糖與非糖部分的苷鍵，本質上都是縮醛鍵，也都存在端基碳原子的構型問題。測定苷鍵構型的問題主要有三種方法，即酶催化水解方法、分子旋光差法(Klyne法)和NMR法。

　　1.利用酶水解進行測定　如麥芽糖酶能水解的為α一苷鍵，而杏仁苷酶能水解的為β一苷鍵。但必須注意并非所有的β一苷鍵都能為杏仁苷酶所水解。

　　2.利用Klyne經驗公式進行計算

　　Klyne根據前人的經驗，得出一個計算公式，即先測定未知苷鍵構型的苷及其水解所得苷元的旋光度，再通過計算得到其分子比旋[M]D，然后用苷的分子比旋[M]D苷減去苷元的分子比旋[M]D苷元，求得其差值為△[M]D。公式如下：

　　△[M]D=[M] D苷一[M] D苷元

　　3.利用NMR進行測定　1HNMR：葡萄糖，β-苷鍵JH1-H2=6～8Hz，α-苷鍵JH1-H2=3～4Hz。注意鼠李糖、甘露糖不能用上法鑒別。

　　13CNMR：1JC1-H1=170Hz(α-苷鍵)，1JC1-H1=160Hz(β-苷鍵)。

　　練習題

　　X型題

　　苷類化合物確定糖鏈結構要解決的問題是

　　A.糖鏈中糖的元素比

　　B.糖鏈中糖的種類和比例

　　C.糖之間的連接位置

　　D.糖之間的連接順序

　　E.糖之間苷鍵的構型

　　『正確答案』BCDE

　　確定苦杏仁苷苷鍵的構型，可選用的方法有

　　A.苦杏仁酶酶解法

　　B.1HNMR譜端基H的J值

　　C.13CNMR譜端基C的lJch值

　　D. 13CNMR譜端基C的δ值

　　E. 1HNMR譜端基H的δ值

　　『正確答案』ABCD

　　確定苷鍵構型的方法有

　　A. 酸水解法

　　B. 堿水解法

　　C. 酶催化水解法

　　D. 克分子比旋光差(Klyne)法

　　E. NMR法

　　『正確答案』CDE

　　B型題

　　(1～5)

　　A.糖的種類

　　B.苷元的種類

　　C.苷的分子量

　　D.單糖間連接位置

　　E.苷鍵的構型

　　1.苷經酸水解后有機溶劑層的薄層色譜可檢識

　　『正確答案』B

　　2.苷經酸水解后水層的紙色譜可檢識

　　『正確答案』A

　　3.苷的1HNMR譜中的JH1H2 可確定

　　『正確答案』E

　　4.苷的13CNMR譜的苷化位移可確定

　　『正確答案』D

　　5.苷的FAB-MS可確定

　　『正確答案』C

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